大小鼠條件性恐懼實(shí)驗測試方法總結（精華篇）

概述

經(jīng)典條件性恐懼，是評估恐懼學(xué)習和記憶的可靠模型。在條件性恐懼期間，動(dòng)物學(xué)會(huì )將先前的非威脅性刺激（指-定為條件刺激或CS）與先天有害刺激（指-定為非條件刺激或US）聯(lián)系起來(lái)。如果這種CS-US關(guān)聯(lián)被成功學(xué)習和記住，先前中性的CS本身將成為US的預測因子，從而引發(fā)原來(lái)US觸發(fā)的恐懼反應（指-定為條件反應或CR）。另外，在此過(guò)程中，動(dòng)物還會(huì )學(xué)習到情境與US的關(guān)聯(lián)。

實(shí)驗設備

條件性恐懼實(shí)驗設備的主要和基本組成部分是：條件性恐懼測試室、隔音通風(fēng)箱和控制軟件。測試室具有導電格柵的地板、電擊發(fā)生器以及紅外探測器，測試室通常由透明有機玻璃制成，可將小鼠的嵌套在大鼠的測試室中。其實(shí)大鼠尺寸的測試室也可以用于小鼠。為了防止動(dòng)物在受到厭惡刺激時(shí)會(huì )跳出測試室，強烈建議測試室設置為有頂蓋的。測試室放置在隔音箱中，隔音箱配備有一個(gè)照明燈、一個(gè)小風(fēng)扇、聲音發(fā)生器以及一個(gè)與聲音發(fā)生器相聯(lián)的擴音器、攝像機和錄音設備。風(fēng)扇用于通風(fēng)和產(chǎn)生背景噪音，這對于以聲音作為CS的情況尤其重要。不同刺激的呈現由具有相應軟件的計算機控制。

VisuFcs條件性恐懼實(shí)驗系統，型號：XR-XC404,上海欣軟

動(dòng)物的行為通常由安裝在頂部的攝像機或位于測試室周?chē)蚣苤械募t外傳感器記錄。視頻記錄或來(lái)自紅外傳感器的信號可以使用指-定的軟件自動(dòng)分析。另一種選擇是在事件記錄器軟件的幫助下人工分析視頻記錄。其他組件包括用于改變測試環(huán)境外觀(guān)的備用地板和墻板等。特定的測試室尺寸可能會(huì )有所不同，但是它們必須適合動(dòng)物（例如，格柵地板間距對大鼠來(lái)說(shuō)更寬），并允許自由移動(dòng)和探索。對于聽(tīng)覺(jué)條件恐懼范式，可以安裝一個(gè)動(dòng)物不可見(jiàn)的LED指示燈在測試小室內，可以用于在沒(méi)有音軌的視頻記錄上指示聲音刺激的呈現。

實(shí)驗動(dòng)物

1、由于跨物種恐懼環(huán)路的保守性，所有品系的實(shí)驗室大鼠和小鼠都可用于經(jīng)典的條件性恐懼范式。一般來(lái)說(shuō)，條件性恐懼行為測試的一個(gè)重要考慮因素是嚙齒動(dòng)物在實(shí)驗時(shí)的年齡。條件性恐懼反射可以在任何年齡的動(dòng)物身上建立，然而，在非常年幼和青少年的動(dòng)物中，學(xué)習和記憶表型與成年動(dòng)物有很大的不同。對于學(xué)習和記憶能力缺陷或增強的一般表型，一般使用成年動(dòng)物（通常周齡在8至16周之間）。

2、從實(shí)驗動(dòng)物供應商處訂購進(jìn)入設施的動(dòng)物應被允許適應新的飼養條件一周或更長(cháng)時(shí)間。

3、實(shí)驗動(dòng)物應飼養在光照、溫度和潛在應激源（如籠子變化、同籠數量或其他干擾）的統一條件下。

4、除非情況要求單籠飼養（如手術(shù)后的動(dòng)物或具有高度攻擊性的動(dòng)物），否則不應單獨飼養嚙齒動(dòng)物，因為這可能會(huì )對行為結果產(chǎn)生不利影響。大鼠通常每個(gè)籠子飼養兩到三只，而每個(gè)籠子最多可以飼養五只小鼠。對于具有攻擊性的小鼠品系，例如C57BL/6小鼠，每籠飼養的雄性小鼠少于5只可能是最佳的。

5、每個(gè)實(shí)驗組所需的動(dòng)物數量應通過(guò)功效分析確定。通常一般情況下7-10只大鼠或10-15只小鼠可以提供足夠的統計功效。

關(guān)鍵參數

1. CS

在經(jīng)典條件性恐懼實(shí)驗中，CS幾乎可以是任何離散的非威脅性線(xiàn)索，例如聲音，光線(xiàn)或氣味。在聽(tīng)覺(jué)條件性恐懼中，常用的CS是一種使用單一頻率音調的中性非有害聲音, 例如，2-10 kHz范圍內的聽(tīng)覺(jué)刺激，其強度約為80 dB。CS呈現的持續時(shí)間因研究而異，范圍從2 s到30 s不等。

2. US

US是有害的或輕度疼痛的。最-常-用的US是輕度電擊，電刺激的優(yōu)點(diǎn)是它們的參數定明確，并且易于控制和管理。如果對動(dòng)物的腳施加電刺激，它們也被稱(chēng)為“足部電擊”。電刺激的強度和持續時(shí)間不同，強度可能在 0.4 至 1 mA之間變化，持續時(shí)間通常為 0.5 s至 2 s 之間。

3. 跟蹤配對刺激

當 CS 和 US 在整個(gè)測試中重復出現但兩者不是同時(shí)出現時(shí)，稱(chēng)為跟蹤配對刺激（圖1）。US通常在CS呈現結束后的相對較短的固定時(shí)間間隔內出現，一般約10 - 20 s，但足以在CS和US之間形成聯(lián)系。但是幾個(gè)CS-US配對之間時(shí)間間隔要長(cháng)一些，大約2.5 - 4.5 min。

4. 延遲配對刺激

當US與CS的呈現共同終止（即，電擊在CS結束時(shí)精確地傳遞），這被稱(chēng)為延遲配對刺激（圖1）。在正常情況下，條件反應在延遲配對刺激處理中比在跟蹤配對刺激中更強，因為CS-US配對在時(shí)間上更緊密地聯(lián)系在一起。跟蹤配對刺激激活海馬，而延遲配對刺激主要激活杏仁核。因此，選擇哪種范式將取決于所要解決的科學(xué)問(wèn)題。

圖 1：跟蹤配對刺激與延遲配對刺激條件性恐懼的示意圖

實(shí)驗程序（測試方法）

1、線(xiàn)索條件性恐懼測試（cued fear conditioning）

2、情境條件性恐懼測試

3、恐懼增強性驚嚇

4、條件性恐懼記憶的消退

凍結時(shí)間通常表示為 CS 持續時(shí)間的百分比，并在每次測試中取平均值。例如，如果一只動(dòng)物在30秒的長(cháng)CS呈現過(guò)程中凍結了24秒，就代表它在該試驗中顯示出80%的凍結反應。評價(jià)情境恐懼時(shí)，可以使用凍結時(shí)間占整個(gè)測試持續時(shí)間的百分比作為統計指標。對于消退測試，應對測試中的每個(gè)CS進(jìn)行單獨分析，而不是取平均值，因為凍結行為會(huì )逐漸減少。如果CS呈現的數量非常多，單獨分析每個(gè)CS下的凍結行為導致曲線(xiàn)非常雜亂，則可以將連續幾個(gè)（2-5個(gè)）CS作為一個(gè)試驗塊，將每個(gè)試驗塊的數據平均，這可能有助于簡(jiǎn)化曲線(xiàn)。在情境恐懼消退的情況下，可以將測試分解為例如 1 或 2 分鐘的間隔，以評估恐懼消退的獲得。另一個(gè)不太常用的參數是凍結行為次數，以總數表示。

驚嚇?lè )磻@示出一定程度的個(gè)體內和個(gè)體間變異性，因此需要進(jìn)行較多試驗，并且推薦匹配方式分組，即根據基線(xiàn)驚嚇?lè )磻獙⑿∈蠡虼笫蠓峙涞綄?shí)驗組和對照組，以確保在實(shí)際實(shí)驗開(kāi)始之前各組均值彼此之間沒(méi)有差異。除了恐懼CS 驚嚇刺激試驗外，還包含單獨的驚嚇刺激試驗。對“單獨驚嚇”和“CS驚嚇”的平均反應的差異稱(chēng)為恐懼增強，以絕對值或“單獨驚嚇”幅度的百分比變化來(lái)表示。

通常建議不要只分析條件性恐懼的單一測量，特別是如果使用的設置和/或方案允許測試更多的恐懼反應。例如，動(dòng)物可以將恐懼反應從凍結行為轉換為逃跑反應。這種逃跑反應也可以通過(guò)跟蹤軟件中的速度閾值自動(dòng)檢測。如果不知道逃跑反應在實(shí)驗中增加，那么在這個(gè)實(shí)驗中觀(guān)察到凍結減少將被錯誤地解釋為恐懼減少。