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技術(shù)文章
VisuGait 動(dòng)物步態(tài)分析系統是通過(guò)腳印光亮折射技術(shù)，采用高速攝像機采集移動(dòng)中的大小鼠行走過(guò)程中的足印信息，然后利用我公司自主開(kāi)發(fā)的足印步態(tài)分析系統自動(dòng)識別分析小鼠的步態(tài)指標，以評價(jià)小鼠的運動(dòng)和空間學(xué)習能力。評價(jià)指標包括：觸地面積、擺動(dòng)速度、擺動(dòng)時(shí)長(cháng)、制動(dòng)時(shí)長(cháng)、步行周期、前后肢步寬、正常步序比等等，以此客觀(guān)評價(jià)PD模型的步態(tài)改變。
動(dòng)物步態(tài)分析系統可用于評價(jià)神經(jīng)創(chuàng )傷、神經(jīng)性萎-縮、神經(jīng)疾病、以及疼痛癥狀群的動(dòng)物模型。該系統應用范圍包括：脊索損傷、神經(jīng)性疼痛、關(guān)節炎、中風(fēng)、帕金森病、運動(dòng)失調、腦損傷、外周神經(jīng)損傷等疾病的研究。通過(guò)步態(tài)分析，了解神經(jīng)源性疾病發(fā)展過(guò)程、評價(jià)治療方法的效果和篩選治療藥物。
帕金森氏癥導致肢體動(dòng)作僵硬和協(xié)調性降低。步態(tài)分析系統通過(guò)測量動(dòng)物模型中的腳間距離、擺動(dòng)時(shí)相、支撐方式和正常步序比等參數評估運動(dòng)協(xié)調性。
摘要
帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是全-世-界-范圍內第二大神經(jīng)退行性疾病，由于目前并未開(kāi)發(fā)出前期的診斷方法，在病程中后期已無(wú)法根-治，臨床上多采用保守治療，藥物緩解癥狀和手術(shù)輔助治療。目前常用左旋多巴來(lái)彌補多巴胺能神經(jīng)元缺失所引起的多巴胺分泌不足，但是這種藥物緩解PD癥狀依賴(lài)于多巴脫羧酶的催化而發(fā)揮藥效，隨著(zhù)晚期PD病人的神經(jīng)元缺失，這種酶也將減少，只能在早期發(fā)揮比較明顯的作用，加大藥量的同時(shí)也將產(chǎn)生更加明顯的副作用，除了增加肝腎負擔以外，還會(huì )引起不自主運動(dòng)和精神錯亂等癥狀，因此，繼續探索PD的發(fā)病機制，尋找更加合適的藥物靶標挽救神經(jīng)元的缺失并探索合適的藥物仍然是探索的方向。
研究背景
帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是一種神經(jīng)退行性疾?。∟eurodegenerative disease），具有不斷演變的復雜性。是以黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)元的嚴重缺失以及路易小體和神經(jīng)突觸內含物的積累和擴散為主要病理標志的神經(jīng)系統疾病。帕金森病被認為是繼阿爾茨海默病之后第二大的神經(jīng)退行性疾病，成為世界上患者增長(cháng)速度最快的神經(jīng)退行性疾病，自1990年到2015年的25年間，病患人數增長(cháng)已一倍，達到600多萬(wàn)。隨著(zhù)全球老齡化愈加嚴重，預計到2040年，病患人數將再增長(cháng)一倍。PD的發(fā)病機制和病因至今尚未明確， 并沒(méi)有任何一種獨立學(xué)說(shuō)能夠闡明其分子致病機制，已經(jīng)證明的分子機制包括氧化應激下活性氧簇（Reactive oxygen species，ROS）的過(guò)量產(chǎn)生、α-突觸核蛋白（α-synuclein）沉積、多巴胺（DA）合成減少或線(xiàn)粒體功能障礙等。主要影響運動(dòng)神經(jīng)系統，臨床癥狀主要包括：1.運動(dòng)癥狀：靜止性震顫、僵硬、步態(tài)異常等。2.睡眠障礙、認知障礙和抑郁等。
為此，探究 PD 致病機制，闡明神經(jīng)元缺失的分子機理或許是突破現有PD治療策略的重要方向。
實(shí)驗材料：
1.A53T轉基因小鼠或基因敲除小鼠（品系均為C57BL/6J）。
2.10%酒精用于擦拭步態(tài)玻璃板。
注：75%酒精氣味刺激性大，頻繁使用將導致小鼠不愿通過(guò)跑道。
3.衛生紙。
4.空籠盒。
行為學(xué)測試步驟包括：
（1）VisuGait 動(dòng)物步態(tài)分析系統軟件，該軟件從位于t臺跑道下方的攝像機接收信息，并檢測由于對跑道表面施加壓力(例如，通過(guò)放置爪子)而從跑道表面反射的光線(xiàn)。
（2）把老鼠放到t臺的一邊。
（3）通過(guò)簡(jiǎn)單的按鈕點(diǎn)擊，以電子方式啟動(dòng)系統。
（4）讓動(dòng)物走到跑道的另一邊。
模型建立與藥物處理：
目前PD常用模型有神經(jīng)毒素模型和基因編輯模型，其中神經(jīng)毒素模型應用更加廣泛。本課題兩種模型均有涉及，對PD模型A53T轉基因小鼠或基因敲除小鼠，使用小動(dòng)物麻醉機對小鼠按推薦計量使用異氟烷進(jìn)行麻醉后固定于腦立體定位儀上，通過(guò)顱骨鉆在小鼠顱骨上鉆孔，將顯微注射針植入鉆孔側大腦紋狀體區域后，使用 6-OHDA（8 mg/kg）對敲除小鼠紋狀體注射，聯(lián)同使用治療藥物21天。
動(dòng)物生存環(huán)境：
將雌雄小鼠分開(kāi)飼養每籠4-5只，分籠可避免發(fā)情和交配引起的激素水平改變，影響行為學(xué)的測試。室溫控制在22-25℃，12-12小時(shí)光暗循環(huán)的安靜環(huán)境中。給予充足的食物和飲用水。
Tip：實(shí)驗動(dòng)物生存環(huán)境一定要安靜， 驚恐狀態(tài)下的小鼠，行為異常，不能反映真實(shí)行為學(xué)指標。每組小鼠最好不少于8只，以減少個(gè)體間差異，避免實(shí)驗偶然性。選擇12-14周齡小鼠，神經(jīng)退行性疾病小鼠隨著(zhù)年齡增加，神經(jīng)元缺失更加嚴重，年齡太大，在病程后期，小鼠無(wú)法直立行走，年齡太小，表型不明顯，觀(guān)測不到運動(dòng)異常指標。
提前適應環(huán)境：將小鼠提前兩天放入測試環(huán)境空間飼養（最好是將設備放在飼養環(huán)境測試），更換環(huán)境后，小鼠因為空調出風(fēng)口方向、光線(xiàn)照射位置、環(huán)境氣味等改變，而表現出焦慮情緒，而PD患者本身就存在非運動(dòng)癥狀，環(huán)境可能影響實(shí)驗結果。
設備調試：步態(tài)利用的是腳印光亮折射技術(shù)，建議實(shí)驗者提前一天在實(shí)驗預計進(jìn)行的同一時(shí)間段調試設備。
Tip：白天和夜晚的采光不同，通道的光線(xiàn)明暗對腳印識別至關(guān)重要，最初光調試設備就可能要花費幾個(gè)小時(shí)。其次是相機參數設置，在多數神經(jīng)退行性疾病模型中，需要分時(shí)間段進(jìn)行行為學(xué)測試，進(jìn)入步態(tài)軟件設置標尺需要用A4紙畫(huà)一個(gè)實(shí)體的標尺，在課題進(jìn)行過(guò)程中，最好使用同一標尺，也不要改變軟件中方框的大小，因為軟件是通過(guò)等比例計算擺動(dòng)距離、步長(cháng)、前后肢間距等長(cháng)度相關(guān)指數，只有在同一標尺下，不同時(shí)間段的指標才有比較的意義。
測試前訓練：步態(tài)分析的測試前訓練是必要的，將實(shí)驗鼠放入步態(tài)跑道上，第一次上跑道可將同籠鼠一起放入跑道5-10分鐘，保持安靜環(huán)境下，不進(jìn)行測試，當老鼠通過(guò)通道，它會(huì )記住有一個(gè)出口可以回到籠子里和同伴待在一起，這將會(huì )是老鼠真正通過(guò)通道的動(dòng)機。然后分別將實(shí)驗小鼠放入跑道一端，將另一端用擋板封堵，在電腦前等待小鼠進(jìn)入錄像區域開(kāi)始記錄。
Tip：測試開(kāi)始時(shí)，實(shí)驗小鼠并不能很好適應環(huán)境，在驚恐狀態(tài)下不會(huì )馬上通過(guò)通道，切勿驅趕、恐嚇?lè )绞酱偈剐∈笸ㄟ^(guò)跑道，一只老鼠幾乎不會(huì )停留在玻璃板上超過(guò)20分鐘不動(dòng)，可能測試兩三百只才回出現一次。在陌生環(huán)境中食物引誘的方法也不可取。在一個(gè)新的環(huán)境中，老鼠甚至不愿意嘗試這種方法，因為這可能讓他們覺(jué)得會(huì )威脅到健康。老鼠是全-球-最-成功的物種之一，它們非常聰明，通常會(huì )避免嘗試任何新事物，除非是為了獲益而承擔風(fēng)險。通過(guò)限制飼養糧食的量，每次通過(guò)通道后，通過(guò)獎勵小食物顆粒來(lái)刺激動(dòng)物穿過(guò)人行道，也有研究者這樣操作。絕大多數(>95%)的小鼠在經(jīng)過(guò)1-2周的訓練后（動(dòng)物被要求在每天12克的食物限制下每天跑2次），就能夠迅速地連續跑過(guò)步態(tài)設備的玻璃板。這可能是小鼠天生的探索天性所使然。特別注意介紹步態(tài)相關(guān)文獻中都強調了小鼠是在自愿狀態(tài)下通過(guò)通道，記錄真實(shí)的步態(tài)的。
在自然界中老鼠作為獵物，主要生活在地下，遠離光線(xiàn)的環(huán)境中，老鼠是典型的膽小動(dòng)物，任何外界施加的壓力都有可能擾亂研究結果。強烈建議，在進(jìn)行任何行為測試，實(shí)驗者可以多花點(diǎn)時(shí)間接觸自己的小鼠，以便它們熟悉人類(lèi)接觸。在隨后的行為測試中，習慣于被研究人員拿起，突然被拿起來(lái)比安靜待在籠子里的老鼠焦慮得多。當然，不建議實(shí)驗者抓著(zhù)老鼠的尾巴將它提起，這是老鼠最敏感的部位之一。在籠子里觀(guān)察到實(shí)驗小鼠的任何與焦慮相關(guān)的行為（打架、理發(fā)、過(guò)度梳理）也很重要，并在必要時(shí)采取措施進(jìn)行干預。如果觀(guān)察到打斗，可以將發(fā)起攻擊的老鼠隔離并移出籠子。
不要俯視老鼠，不管你從哪個(gè)角度看著(zhù)老鼠，它都會(huì )誤以為是捕獵者，不要嘗試推它或者恐嚇它讓它往前走，這會(huì )使它更不愿意行走。相反，如果你將它放在通道上，不被人注意到，在比較封閉的步態(tài)系統中它將會(huì )自由行走。
在一個(gè)新的環(huán)境中，老鼠甚至不愿意嘗試這種方法，因為這可能會(huì )威脅到它們的健康。請記住，老鼠是全-球-最-成功的物種之一，它們非常聰明，他們通常會(huì )避免嘗試任何新事物，除非他們能承擔風(fēng)險，并能從結果中獲益。
在進(jìn)行正式的行為學(xué)測試之前，研究者必須要熟悉設備和軟件，VisuGait 動(dòng)物步態(tài)分析系統使用起來(lái)非常直觀(guān)和簡(jiǎn)便。只需要多進(jìn)行幾次測試，確保在正式測試時(shí)能夠熟悉操作儀器和軟件。
用擋板擋住通道回到小鼠籠的出口，將實(shí)驗小鼠放置在通道入口，回到電腦前等待小鼠通過(guò)相機測試區域，不要嘗試反復將小鼠放在同一位置開(kāi)始，然后通過(guò)通道后又拿回起點(diǎn)，這樣反復操作，小鼠會(huì )誤以為自己的行為是錯誤的，導致它更長(cháng)時(shí)間的停留。只需要將小鼠放置在入口，然后等待小鼠在玻璃板上來(lái)回行走時(shí)做好記錄即可。記錄數據時(shí)，在讓軟件上有“從右至左”和“從左至右”的選擇，小鼠將在通道上來(lái)回行走，建議每只小鼠測5次以上，保證有清晰記錄的圖像記錄。收集每只老鼠的多次連續的行走，并對這些行走進(jìn)行平均分析，這可以減少實(shí)驗誤差。讓每個(gè)實(shí)驗老鼠多跑三次只需要多花幾分鐘，但是這對準確了解實(shí)驗小鼠的總體步態(tài)有很大的幫助。
測試過(guò)程中，實(shí)驗鼠隨時(shí)會(huì )有大小便，使用10%酒精擦拭玻璃板，并迅速擦干，避免糞便污漬影響實(shí)驗。老鼠是嗅覺(jué)十分敏感的動(dòng)物，在行為學(xué)測試過(guò)程中，老鼠發(fā)現擋板和玻璃板上有其他不熟悉的味道，都會(huì )導致老鼠停止前進(jìn)，分散注意力。
Tip：開(kāi)始的前幾只小鼠，需要立即進(jìn)行步行分析，查看行為學(xué)測試結果有幾十個(gè)指標被檢測，通過(guò)傳統的一次測試用一個(gè)表格導出數據不方便統計，通過(guò)與步態(tài)售后工程師溝通，開(kāi)發(fā)了將一次實(shí)驗所有檢測指標匯總成同一表格內進(jìn)行統計，大大簡(jiǎn)潔了統計過(guò)程。進(jìn)圖、壓力圖、步序圖等參數是否可以正常記錄。
測試時(shí)間盡量保證在同一時(shí)間段進(jìn)行，白天光照強，到夜晚可能需要重新調整通道的兩種LED燈亮度，重新檢查各項參數是否正常，將增加不必要的時(shí)間成本。其次，老鼠的運動(dòng)活躍程度可能與晝夜節律有關(guān)。
測試過(guò)程中盡量不要說(shuō)話(huà)和產(chǎn)生噪音，特別是老鼠痛苦時(shí)發(fā)出的吱吱聲，最好是在有舒緩的背景音樂(lè )狀態(tài)下進(jìn)行實(shí)驗。正常情況下，老鼠受到驚嚇和噪音都會(huì )導致實(shí)驗小鼠本能停止，在奔跑過(guò)程中老鼠會(huì )因為其他聲音暫時(shí)停止前進(jìn)。
不同時(shí)間點(diǎn)檢測同一項目實(shí)驗鼠行為學(xué)參數，必須保證相機參數和標尺一致，才有可比性。
行為學(xué)測試結果有幾十個(gè)指標被檢測，通過(guò)傳統的一次測試用一個(gè)表格導出數據不方便統計，通過(guò)與步態(tài)售后工程師溝通，開(kāi)發(fā)了將一次實(shí)驗所有檢測指標匯總成同一表格內進(jìn)行統計，大大簡(jiǎn)潔了統計過(guò)程。
擺動(dòng)時(shí)長(cháng)（Swing Duration）：擺動(dòng)時(shí)長(cháng)會(huì )隨著(zhù)速度的增加而減少，同時(shí)也有一個(gè)限度。關(guān)節炎動(dòng)物可能會(huì )因為關(guān)節機動(dòng)性的損失而使擺動(dòng)時(shí)長(cháng)增加。疼痛狀態(tài)下擺動(dòng)時(shí)長(cháng)會(huì )增加，較長(cháng)的前肢擺動(dòng)持續時(shí)間可以提供給小鼠充分的機會(huì )讓其在負載前進(jìn)行臂肢放置。
擺動(dòng)百分比（% Swing）: 假設整個(gè)步幅時(shí)長(cháng)（Stride Duration）是*，那么X%是腳爪接觸（ stance）， Y%是非腳爪接觸（ swing）。X% stance+Y% swing=100% stride。典型的% swing大約為35%；此數值在加速狀態(tài)下會(huì )明顯增加。
步幅長(cháng)度（Stride Length）：同一腳爪的連續步幅之間的距離，正常狀態(tài)下，給定動(dòng)物的4個(gè)腳爪的此項數值幾乎相等。胎兒期和初生期給予酒精會(huì )導致步幅長(cháng)度顯著(zhù)地變短，當嚙齒動(dòng)物行走速度提高，步幅長(cháng)度也會(huì )提高，觸地時(shí)長(cháng)會(huì )減少，有關(guān)節炎的小鼠同樣會(huì )有較短的步幅長(cháng)度。
觸地寬度（Stance Width）：一般地，前肢的觸地寬度會(huì )小于后肢的觸地寬度，此距離和身體尺寸有依賴(lài)性。更大或者更小的數值可能指示為穩定性而進(jìn)行的姿勢調整。人類(lèi)會(huì )因為較少穩定而避免狹窄的腳步寬度。觸地寬度有時(shí)候被稱(chēng)為“支撐基礎”。
腳爪面積（Paw Area）：腳爪面積可以指示足底放置范圍作為神經(jīng)損傷、體肢負載能力和疼痛程度的依據。例如，有慢性疼痛癥的大鼠表現出有前后腳爪面積的改變。在Huntington舞蹈病的轉基因模型上，后肢腳爪面積較小，但是在唐氏綜合癥模型上卻無(wú)變化。
步幅時(shí)長(cháng)（Stride Duration）：小鼠在正常步行速度下的主導踏步模式是交替形式的，步幅時(shí)長(cháng)取決于運動(dòng)速度和步幅頻率。所有體肢的步幅時(shí)長(cháng)通常情況下是基本相等的。
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