解讀慢性社交挫敗應激模型測試流程、數據分析及注意事項

神經(jīng)精神病學(xué)研究中的重大挑戰之一便是開(kāi)發(fā)能準確反映與情感障礙相關(guān)的癥狀的動(dòng)物模型。慢性社交挫敗應激模型已被證明是研究抑郁癥的有效模型。在該模型中，C57BL/6J小鼠連續10天遭受CD-1小鼠攻擊，誘導其產(chǎn)生慢性社交挫敗應激。本文描述了CD-1攻擊小鼠的篩選過(guò)程，C57BL/6J和CD-1攻擊小鼠之間的社交互動(dòng)，以及作為抑郁樣行為指標的社會(huì )回避評分的分析。

關(guān)鍵詞：社交挫敗，抑郁，慢性應激，社會(huì )互動(dòng)，小鼠模型

 研究背景

抑郁癥是一種反復發(fā)作且危及生命的疾病，影響著(zhù)全球約1.2億人。在神經(jīng)精神病學(xué)研究領(lǐng)域中，開(kāi)發(fā)有效的抑郁癥動(dòng)物模型至關(guān)重要，有效的動(dòng)物模型可幫助人類(lèi)理解抑郁癥背后的神經(jīng)和分子機制。目前，用于誘發(fā)小鼠的抑郁癥的各種慢性應激包括：慢性不可預測應激，足部電刺激應激，束縛應激等，隨后可測量其快感缺失或絕望行為（如蔗糖偏愛(ài)測試，強迫游泳測試和懸尾測試），但這些慢性應激誘發(fā)的抑郁效果都不夠理想。與此同時(shí)，慢性社交挫敗應激由于其可靠性和可重復性，已被廣泛接受為抑郁癥的有效模型。社交挫敗范式已被證實(shí)為一種很好的抑郁模型，原因如下：1)易感小鼠的抑郁表型（社交回避、快感缺失、代謝變化等）可通過(guò)慢性抗抑郁藥物的治療而逆轉，但急性給藥對其沒(méi)有效果。2)社交挫敗應激產(chǎn)生易感表型和抗性表型可以用來(lái)解釋抑郁癥病理生理學(xué)中人類(lèi)應激易感性的個(gè)體差異。3)由社交挫敗應激引起的易感表型是長(cháng)期存在的，并伴隨著(zhù)大腦獎賞回路的遺傳和表觀(guān)遺傳變化。

 材料和試劑

1、C57BL/6J小鼠（購自Jeckson實(shí)驗室）：使用7-8周齡小鼠進(jìn)行社交挫敗造模（6-7周齡小鼠需要進(jìn)行一周的環(huán)境適應期）

注：小鼠置于標準籠里，每個(gè)籠子限4-5只小鼠。

2、CD-1小鼠（(Charles River實(shí)驗室）：將4-6個(gè)月大的雄性非繁殖鼠單獨飼養于標準鼠籠內。

注：社交挫敗范式使用受試小鼠的統一從屬關(guān)系作為社交應激源，在本方案中采用了最常見(jiàn)的C57BL/6J：CD-1從屬關(guān)系。

清潔試劑（用于清潔場(chǎng)地和作為社交互動(dòng)場(chǎng)地/分隔器的樹(shù)脂玻璃）：0.5%過(guò)氧化氫。

設備

1.透明鼠籠（帶墊料的一次性鼠籠）（Innovive，目錄編號：RS1-H-C8)

2.標準水瓶（小鼠水瓶）（Innovive，目錄編號：M-WB-300)

3.帶吸管的水瓶塞（氯丁橡膠塞）（Ancare，目錄編號：OT-199-3"）

4.圓筒支架（定制的塑料支架，可作為額外的水口；圖2B)

5.分隔器（定制的透明穿孔樹(shù)脂玻璃板；圖2B)

6.可拆卸外殼（定制的透明有機玻璃，頂部和底部均打開(kāi)；圖3B)

7.秒表

8.露天試驗室（定制，44（寬）x 44（長(cháng)） x 30（高）；厘米）

9.社交互動(dòng)測試視頻跟蹤系統（如VisuTrack動(dòng)物行為分析軟件，CCD攝像機及計算機）

實(shí)驗流程

1、CD-1攻擊性小鼠的篩選 

a.訂購4-6個(gè)月大的雄性CD-1小鼠（至少多訂購2-3倍，因為只有不到一半的CD-1小鼠具有足夠的攻擊性）。CD-1小鼠單獨安置在標準鼠籠里，給予足夠的食物和水。并使CD-1小鼠在開(kāi)始篩選過(guò)程前適應它們的新環(huán)境一周。

b.僅用于篩選CD-1小鼠的C57BL/6J雄性“篩選鼠"?！昂Y選鼠"的年齡范圍在8-20周，并可用于后續的篩選過(guò)程。在此過(guò)程中需要排除具有攻擊性的“篩選鼠"。

c.CD-1小鼠的篩選是在CD-1小鼠的籠子中進(jìn)行的。C57BL/6J“篩選鼠"直接放入CD-1小鼠籠中5 min。記錄每只CD-1小鼠的攻擊潛伏期，連續3天，每天一次，進(jìn)行三次篩選。

d.CD-1攻擊小鼠的篩選標準：在三次篩選過(guò)程中，CD-1攻擊小鼠連續兩個(gè)階段初始攻擊潛伏期必須小于60秒，且必須連續攻擊C57BL/6J “篩選鼠"至少10秒。

e.CD-1攻擊小鼠在初始篩選后可使用3個(gè)月（CD-1攻擊性小鼠可能習慣社交挫敗過(guò)程，因此需要在下一次社交挫敗實(shí)驗之前重新篩選）。

2、慢性社交挫敗應激（圖1）

圖1|社交挫敗應激造模和社交互動(dòng)測試的示意圖（慢性社交挫敗造模方案使用CD-1攻擊性小鼠執行了連續10天的社交挫敗，然后進(jìn)行社交互動(dòng)測試和后續分析）

a.組裝社交挫敗籠（圖2A)，取標準鼠籠，籠底部填充木片墊料。將穿孔的有機玻璃分隔板放置在籠子的中心。社交挫敗鼠被隔離出來(lái)，并允許其在非社交挫敗區域內進(jìn)行感官互動(dòng)。放置圓柱體（附加的水瓶架）在標準水瓶的對面。用圓筒支架插入組裝好的水瓶。確保鼠能飲用到水。將食物放在兩側的底部（水和食物應隨意供應）。將標準鼠籠蓋牢固地放在鼠籠上。為期10天的社交挫敗方案至少需要10個(gè)帶有CD-1攻擊鼠的社交挫敗籠。

注意：分隔器應裝配牢固，防止小鼠逃逸。

圖2|慢性社交挫敗應激的標準籠（A.用于慢性社交挫敗應激造模的標準鼠籠：CD-1攻擊小鼠被永-久安置在穿孔分隔器的一側，而C57BL/6J小鼠每天在兩側交換位置，以防止對攻擊的習慣化。B. 標準鼠籠的附加部件尺寸（定制）：在標準水瓶側的對面的圓筒支架裝有一個(gè)額外的水瓶。在非社交挫敗環(huán)節期間，穿孔的有機玻璃分隔器隔離兩種老鼠（允許感官互動(dòng)））。

b.在社交挫敗環(huán)節開(kāi)始前一晚，將CD-1攻擊鼠放置在已被分隔的鼠籠的一側，使其適應新環(huán)境。

注：首-選圓筒支架側。

c.在社交挫敗環(huán)節的第一天，將C57BL/6J小鼠直接放入CD-1攻擊小鼠同一側。在5-10 min的社交挫敗后（視頻源如下），將C57BL/6J鼠轉移到穿孔隔板的對側，持續24小時(shí)。

注意：在社交挫敗環(huán)節開(kāi)始時(shí)，將C57BL/6J鼠放在靠近CD-1攻擊鼠附近有助于啟動(dòng)其攻擊性行為?？赏瑫r(shí)對10只受試小鼠進(jìn)行社交挫敗應激。

d.對照組應將C57BL/6J小鼠放置在一個(gè)相同的社交挫敗籠中，在穿孔有機玻璃分隔器的兩側各設置一只小鼠（將CD-1小鼠替換為C57BL/6J小鼠），持續10天，禁止任何身體接觸。這些小鼠同樣在隔板兩側轉換。

e.每只受試的C57BL/6J小鼠將每天面臨1只不同的CD-1小鼠，連續重復上述社交挫敗操作10天。

f.在最后一次社交挫敗之后，單獨飼養所有C57BL/6J小鼠。所有的CD-1攻擊性小鼠也都送回它們單獨飼養的籠子里，用于未來(lái)的社交挫敗實(shí)驗（未來(lái)需要根據其攻擊性重新篩選）。

3、社交互動(dòng)測試

a.社交互動(dòng)測試在最后一次社交挫敗后24小時(shí)進(jìn)行。在社交互動(dòng)測試中，CD-1攻擊小鼠對于被測試的C57BL/6J小鼠應該是完-全陌生的。在進(jìn)行社交互動(dòng)測試前，篩選CD-1攻擊性小鼠，以確保小鼠符合攻擊性標準。

b.社交互動(dòng)場(chǎng)地如圖3所示。配置視頻跟蹤系統（如VisuTrack軟件），通過(guò)跟蹤軟件自動(dòng)收集所有數據。

圖3|社交互動(dòng)測試場(chǎng)地的示意圖（A.社會(huì )互動(dòng)分析的區域劃分。B. 可拆卸的穿孔有機玻璃外殼，外殼內部放入CD-1小鼠）

c.在與外部噪聲源和動(dòng)物隔離及紅光條件下，于社交互動(dòng)測試前先讓受試鼠適應環(huán)境1小時(shí)。

d.在紅光條件下，每個(gè)社交互動(dòng)測試都由兩個(gè)2.5 min的階段組成。在第一階段，將社交挫敗模型小鼠放入社交互動(dòng)區域（在有機玻璃外殼對面的中心），并允許其在沒(méi)有CD-1小鼠的情況下自由探索。

注意：在第一階段比賽結束后，不要清理實(shí)驗場(chǎng)地。

e.在第一階段結束后，將模型鼠取回，直到第二階段。然后，將CD-1鼠標直接放入有機玻璃外殼內。

注意：將CD-1鼠從外殼頂部輕輕放下。

f.在第二階段，重新放入模型鼠，并讓它在CD-1小鼠存在的情況下自由移動(dòng)。

注意：在兩個(gè)階段之間以相同的方式放置模型鼠。

g.在每次測試結束時(shí)。使用清潔液清洗所有設備。

h.數據可以按照數據分析部分中的描述進(jìn)行分析。

 數據分析 

使用自動(dòng)視頻跟蹤系統，可以從每個(gè)試驗的視頻數據中計算出交互區和角落區的停留時(shí)間。在本研究中，對照組小鼠通常在互動(dòng)區花費的時(shí)間更多，而模型鼠的社交互動(dòng)時(shí)間顯著(zhù)減少（圖4）。因此，小鼠的社交能力可以通過(guò)比較在CD-1鼠的互動(dòng)區域內的停留時(shí)間來(lái)量化。社交互動(dòng)比（SI ratio）計算方法如下：

注：Interaction zone time of "target" trial——CD-1攻擊鼠存在情況下，受試鼠在互動(dòng)區域內停留時(shí)間；

Interaction zone time of "no target" trial——CD-1攻擊鼠不存在的情況下，受試鼠在互動(dòng)區域內停留時(shí)間。

SI比值低于100%的小鼠被歸為抑郁易感小鼠，另一方面，SI比值超過(guò)100%的小鼠屬于抑郁抗性組。在大多數情況下，超過(guò)一半的C57BL/6J小鼠在受到慢性社交挫敗應激時(shí)表現出易感表型。角落區停留時(shí)間是社交回避的另一個(gè)有用指標，它往往與互動(dòng)區停留時(shí)間呈負相關(guān)（圖4B）。

圖4|社交互動(dòng)測試的統計分析

  注意事項

1、針對社交挫敗應激籠的設置可以有所不同，還可以根據籠的形狀和尺寸對分隔器、圓筒等附加設備進(jìn)行修改或替換。

2、社會(huì )挫敗持續時(shí)間（5-10 min）可以根據CD-1攻擊性小鼠的攻擊性來(lái)調整，以應對適當的身體壓力，避免造成嚴重傷害。仔細觀(guān)察每一個(gè)過(guò)程，替換那些攻擊性太強（持續留下開(kāi)放性傷口）或在社交挫敗過(guò)程中攻擊性不夠的CD-1小鼠。對嚴重受傷的社交挫敗鼠實(shí)施安-樂(lè )-死。

3、社會(huì )挫敗方案的變化：為了縮短應激周期（例如與病毒表達周期相一致，如HSV）或減少對植入套管的損傷（例如光遺傳學(xué)），可以適當縮短社會(huì )挫敗應激范式的造模時(shí)間。

a.單次最大社交挫敗應激方案（1天）：將小鼠放入CD-1鼠的籠子中5分鐘，然后休息15分鐘；用新的CD-1鼠重復上述步驟至少兩次。

b.短期社交挫敗應激方案（4~5天）：造模小鼠每天經(jīng)歷兩次社交挫敗，持續4~5天。